|
|
Příprava expresních vektorů a virových mutant pro studium minoritních strukturních proteinů polyomavirů
Cibulka, Jakub ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Polyomaviry jsou malé neobalené DNA viry infikující ptáky a savce, včetně člověka. Jejich kapsida je tvořena hlavním kapsidovým proteinem VP1 a dvěma minoritními kapsidovými proteiny VP2 a VP3. Důležitou funkcí minoritních proteinů je pravděpodobně zprostředkování dopravy virového genomu do jádra buňky, aby mohlo dojít k úspěšné replikaci viru. Proteiny VP2 a VP3 myšího polyomaviru a viru SV40 mají schopnost vázat a perforovat buněčné membrány a má se za to, že právě tato jejich vlastnost pomáhá dopravit virový genom do jádra. V rámci této práce byly připraveny plasmidy pro produkci a vizualizaci minoritních kapsidových proteinů polyomaviru karcinomu Merkelových buněk v savčích buňkách. Tyto proteiny se svými sekvencemi výrazně liší od minoritních proteinů ostatních lidských polyomavirů i příbuzného myšího polyomaviru. Při jejich samostatné produkci v buňkách se ukázalo, že na rozdíl od proteinů VP2 a VP3 myšího polyomaviru nevykazují zřetelnou afinitu k membránám. Druhým cílem této práce byla příprava mutant myšího polyomaviru s delecemi v hydrofobních doménách proteinů VP2 a VP3, které by měly být zodpovědné za výše zmíněné membránové interakce. Tyto mutanty nebyly infekční, ale ztráta infektivity může souviset s celkovým ovlivněním produkce pozdních proteinů viru a nejen s funkcí těchto domén jako takových.
|
|
|
Příprava expresních vektorů a virových mutant pro studium minoritních strukturních proteinů polyomavirů
Cibulka, Jakub ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Polyomaviry jsou malé neobalené DNA viry infikující ptáky a savce, včetně člověka. Jejich kapsida je tvořena hlavním kapsidovým proteinem VP1 a dvěma minoritními kapsidovými proteiny VP2 a VP3. Důležitou funkcí minoritních proteinů je pravděpodobně zprostředkování dopravy virového genomu do jádra buňky, aby mohlo dojít k úspěšné replikaci viru. Proteiny VP2 a VP3 myšího polyomaviru a viru SV40 mají schopnost vázat a perforovat buněčné membrány a má se za to, že právě tato jejich vlastnost pomáhá dopravit virový genom do jádra. V rámci této práce byly připraveny plasmidy pro produkci a vizualizaci minoritních kapsidových proteinů polyomaviru karcinomu Merkelových buněk v savčích buňkách. Tyto proteiny se svými sekvencemi výrazně liší od minoritních proteinů ostatních lidských polyomavirů i příbuzného myšího polyomaviru. Při jejich samostatné produkci v buňkách se ukázalo, že na rozdíl od proteinů VP2 a VP3 myšího polyomaviru nevykazují zřetelnou afinitu k membránám. Druhým cílem této práce byla příprava mutant myšího polyomaviru s delecemi v hydrofobních doménách proteinů VP2 a VP3, které by měly být zodpovědné za výše zmíněné membránové interakce. Tyto mutanty nebyly infekční, ale ztráta infektivity může souviset s celkovým ovlivněním produkce pozdních proteinů viru a nejen s funkcí těchto domén jako takových.
|
|
|
Preparation of Monoclonal Antibodies Against VP2 Protein of Human Polyomaviruses
Vochyánová, Klára ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Růžičková, Šárka (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo připravit dva proteinové antigeny a dvě monoklonální protilátky, založené na minoritním proteinu VP2 lidských polyomavirů BK viru a Polyomaviru karcinomu Merkelových buněk. Proběhla příprava monoklonální protilátky proti unikátní části proteinu VP2 BK viru (N-koncový epitop, který se nenachází u proteinu VP3). Buněčná linie produkující protilátku s touto specificitou nebyla zatím nikdy ustavena kvůli nízké imunogenicitě tohoto epitopu. Náš přístup byl z hlediska imunizace myší úspěšný, ale později v průběhu přípravy nastaly vážné problémy se stabilitou hybridomové linie. Dalším cílem této práce byla příprava monoklonální protilátky cílené na sekvenci proteinu VP2 Polyomaviru karcinomu Merkelových buněk. Imunizace myší a hybridomová fúze byly provedeny úspěšně. Po čtyřech kolech klonování za účelem přípravy ustaveného klonu bylo devět klonů vybráno k rozpěstování. Rozpěstování pravděpodobně vedlo ke snížení specificity protilátky a ke ztrátě produkce u většiny hybridomů. Jednou zopakované klonování by mělo vyústit v získání ustaveného klonu s dostatečnou produkcí. Příprava dvou proteinových antigenů byla provedena ve dvou expresních systémech. DNA kódující VP2 protein BK viru zkrácený na C-konci a fúzovaný s His-tagem byla klonována do vektoru vhodného pro expresi v...
|
host ::
RSS.